Этот комплекс не представляет собой какую-то чистую фракцию, сюда входят компоненты и ядерной оболочки, и ядрышка, и кариоплазмы. С ядерным матриксом оказались связаны как гетерогенная РНК, так и часть ДНК. Эти наблюдения дали основание считать, что матрикс ядра играет важную роль не только в поддержании общей структуры интерфазного ядра, но и может участвовать в регуляции синтеза нуклеиновых кислот.

Хроматин

При наблюдении некоторых живых клеток, особенно растительных или же клеток после фиксации и окраски, внутри ядра выявляются зоны плотного вещества. В состав хроматина входит ДНК в комплексе с белком. В интерфазных клетках хроматин может равномерно заполнять объем ядра или же располагаться отдельными сгустками (хромоцентры). Часто он особенно четко выявляется на периферии ядра (пристеночный, примембранный хроматин) или образует внутри ядра переплетения довольно толстых (около 0.3 мкм) и длинных тяжей, образующих подобие внутриядерной цепи.

Хроматин интерфазных ядер представляет собой несущие ДНК тельца (хромосомы), которые теряют в это время свою компактную форму, разрыхляются, деконденсируются. Степень такой деконденсации хромосом может быть различной в ядрах разных клеток. Когда хромосома или ее участок полностью деконденсирован, тогда эти зоны называют диффузным хроматином. При неполном разрыхлении хромосом в интерфазном ядре видны участки конденсированного хроматина (иногда называемого гетерохроматин). Показано, что степень деконденсации хромосомного материала в интерфазе может отражать функциональную нагрузку этой структуры. Чем более диффузен хроматин интерфазного ядра, тем выше в нем синтетические процессы. Падение синтеза РНК в клетках обычно сопровождается увеличением зон конденсированного хроматина.

Максимально конденсирован хроматин во время митотического деления клеток, когда он обнаруживается в виде плотных телец - хромосом. В этот период хромосомы не несут никаких синтетических нагрузок, в них не происходит включение предшественников ДНК и РНК.

в рабочем, частично или полностью деконденсированном, когда с их участием в интерфазном ядре происходят процессы транскрипции и редупликации;

в неактивном - в состоянии метаболического покоя при максимальной их конденсированности, когда они выполняют функцию распределения и перенося генетического материала в дочерние клетки.

В химическом отношении препараты хроматина представляют собой сложные комплексы дезоксирибонуклеопротеидов, в состав которых входит ДНК и специальные хромосомные белки - гистоны. В составе хроматина обнаружено также РНК. В количественном отношении ДНК, белок и РНК находятся как 1:1,3:0,2. О значении РНК в составе хроматина еще нет достаточно однозначных данных. Возможно, что эта РНК представляет собой сопутствующую препарату функцию синтезирующейся РНК и поэтому частично связанной с ДНК или это особый вид РНК, характерный для структуры хроматина.

Ядерный скелет (ядерный матрикс)

Ультраструктура. Ядерный скелет представляет собой следующую систему:

• плотная пластинка (ламина) с норовыми комплексами;
• фибриллярно-гранулярная сеть.

В состав скелета входят негис- тоновыс белки (в том числе актин и миозин), факторы транскрипции, полисахариды, липиды, нуклеиновые кислоты.

Функции. Ядерный скелет выполняет следующие функции:

• поддерживает форму ядра;
• является опорой для хроматиновых структур (в частности, с помощью ядерного скелета хромосомы внутри ядра занимают совершенно определенные нсперекрывающисся области - хромосомные территории; при этом хромосомы, содержащие большое число генов, локализуются ближе к центру ядра);
• обеспечивает внутриядерный транспорт частиц и веществ;
• участвует в регуляции транскрипции.

Биогенез. Формируется в телофазе из растворенных белков.

Ядрышко

Строение. Округлое компактное образование преимущественно нитчатого строения. Структурные компоненты:

• нуклеолонема (основная нитчатая структура, состоит из рибо- ][уклеопротеид] iых нитей);
• гранулярный компонент (рибонуклеопротеидные гранулы);
• ядрышковый хроматин.

Биохимическая характеристика. В состав ядрышка входят следующие компоненты:

• ДНК (в форме дезоксирибонуклеопротеида) содержит гены, кодирующие pPIIK;
• ферменты транскрипции;
• рРНК;
• рибонуклеопротеиды (фибриллы и гранулы - рибосомы на разных стадиях созревания);
• негистоновые белки;
• минеральные компоненты.

Функции. Ядрышко выполняет следующие функции:

• биосинтез РНК;
• сборку рибосомиых частиц (белки приходят из цитоплазмы).

Биогенез. Формируется в телофазе при участии ядрышкового

организатора - специального участка определенной хромососы (подробнее см. морфологическую классификацию хромосом на с. 84).

Хроматиновые структуры

Хроматин и хромосомы - две формы существования одного материала: в ядрах неделящихся клеток - хроматин, в делящихся митозом или мейозом - хромосомы.

Биохимическая характеристика. Хроматиновые структуры содержат следующие компоненты:

• ДНК (в форме дезоксирибонуклеопротеида);
• гистоновые белки;
• нсгистоновыс белки (регуляторные, рецепторные белки и др.);
• ферменты (ДНК-полимераза, РНК-полимераза и др.);
• и PH К, тРНК;
• прочие (минеральные компоненты, липиды и др.).

Молекулярная организация. Хроматиновые структуры представляют собой линейные полимерные образования, состоящие из множества однотипных структурных единиц - нуклеосом. Основу (сердцевину, или кор) нуклеосомы составляет образование, состоящее из восьми молекул гистоновых белков, на которое намотаны в виде левозакручеииой суперспирали 1,75 витка ДНК общей длиной 145 нуклеотидных пар (рис. 3.31). При этом молекулы гистонов взаимодействуют с молекулой ДНК таким образом, что положительно заряженные радикалы входящих в их состав аминокислотных осгаткон нейтрализуют отрицательно заряженные фосфатные группы остова ДНК. Этим обстоятельством объясняется столь компактная упаковка хроматиновых структур в ядре (длина ДНК человека составляет 1,7-2 м, а диаметр клеточного ядра - не более 5-7 мкм).

Молекула ДНК непрерывна и переходит с одной нуклеосомы на другую, соединяя их в линейную структуру - нуклеосомную нить. Участок ДНК между нуклеосомами называется линкерной ДНК; ее протяженность составляет 10-100 нуклеотидных пар. Молекула ДНК не имеет свободных концов. В конечных участках плечей хромосом (теломерах - см. ниже) она образует петлю, фиксированную специальными (теломерными) белками (рис. 3.32), благодаря чему молекула ДНК оказывается защищенной от соединения с концами других молекул ДНК (или двунитевыми разрывами) и от разрушающего действия ферментов.

Рис. 331. Рис. 3.32. Петля ДНК, фиксированная

1 - ДНК; Н2А, Н2В, НЗ, Н4 - специальными белками в области гистоновые белки теломеры (теломерные белки

представлены в виде объемных тонированных фигур)

В интерфазном ядре развернутые хромосомы располагаются не хаотично, а строго упорядоченно. Такая организация хромосомы в трехмерном пространстве ядра необходима не только для того, чтобы при митозе происходили сегрегация хромосом и их обособление от соседей, но и для упорядочения процессов репликации и транскрипции хроматина . Можно предполагать, что для осуществления этих задач должна существовать какая-то каркасная внутриядерная система , которая может служить объединяющей основой для всех ядерных компонентов – хроматина, ядрышка, ядерной оболочки. Такой структурой является белковый ядерный остов, или матрикс .

Ядерный матрикс не имеет четкой морфологической структуры: он выявляется как отдельный морфологический гетерогенный компонент при экстракции из ядер практически всех участков хроматина, основной массы РНК и липопротеидов ядерной оболочки. От ядра, которое не теряет при этом своей общей морфологии, оставаясь сферической структурой, остается как бы каркас, остов, иногда называемый еще «ядерным скелетом». Впервые компоненты ядерного матрикса были выделены и охарактеризованы в начале 60-х годов. Ядерный матрикс состоит, по крайней мере, из трех морфологических компонентов:

• периферического белкового сетчатого (фиброзного) слоя – ламины,
• внутреннего, или интерхроматинового матрикса,
• «остаточного» ядрышка.

Ламина представляет собой тонкий фиброзный слой, подстилающий внутреннюю мембрану ядерной оболочки. В ее состав входят так же комплексы ядерных пор, которые как бы вмурованы в фиброзный слой. Часто эту часть ядерного матрикса называют фракцией «поровый комплекс – ламина» (РСL) . Структурная роль ламины очень велика: она образует сплошной фиброзный белковый слой по периферии ядра, достаточный для поддержания морфологической целостности ядра.

Внутриядерный матрикс морфологически выявляется после экстракции хроматина. Он представлен рыхлой фиброзной сетью, располагающейся между участками хроматина. Часто в состав этой губчатой сети входят различные гранулы.

Остаточное ядрышко – плотная структура, повторяющая по своей форме ядрышко, состоит из плотно уложенных фибрилл.

Компоненты ядерного матрикса – это не застывшие жесткие структуры, они динамически подвижны и могут меняться в зависимости не только от условий их выделения, но и от функциональных особенностей нативных ядер. Основной компонент остаточных структур ядра – белок, содержание которого может колебаться от 98 до 88%. Белковый состав ядерного матрикса из разных клеток довольно близок. Для него характерны три белка фиброзного слоя, называемые ламинами. Кроме этих основных полипептидов в матриксе присутствует большое количество минорных компонентов с молекулярным весом от 11 – 13 до 200 тыс. Ламины представлены тремя белками: А, В, С. Ламины А и С близки друг к другу иммунологически и по пептидному составу. Ламин В отличается от них тем, что он более прочно связывается с интегральными белками ядерной мембраны.

Часто фракция выделенных ядер, а также препараты ядерного матрикса содержат значительные количества промежуточных филаментов, которые остаются связанными с периферией, ядра даже после удаления ядерных мембран. В отличие от промежуточных филаментов ламины при полимеризации не образуют нитчатых структур, а организуются в сети с ортогональным типом укладки молекул. Такие сплошные решетчатые участки подстилают внутреннюю мембрану ядерной оболочки. Они могут разбираться при фосфорилировании ламинов и вновь полимеризоваться при их дефосфорилировании, что обеспечивает динамичность как этого слоя, так и всей ядерной оболочки. Молекулярная характеристика белков внутриядерного матрикса детально не разработана. Белки отвечают за поддержание петлевой организации ДНК.

ДНК ядерного белкового матрикса

Участки ДНК могут быть расположены во всех трех компонентах ядерного матрикса. Были обнаружены две размерные группы фрагментов ДНК в составе ядерного матрикса. В первую группу входили высокомолекулярные фрагменты размером около 10 тыс. н. п., они составляли всего 0,02% от исходного количества ДНК. Их число составляло примерно 100 на гаплоидный набор хромосом, т. е. существует всего 2 – 3 участка прикрепления ДНК к ядерному матриксу на хромосому, Фрагменты были обогащены сателлитной ДНК и связаны с ламиной. Функциональное значение этих участков может состоять в обеспечении фиксированного положения хромосом в ядре с помощью закрепления их определенных участков (центромер, теломер) на ламине. Вторая группа фрагментов , связанных с матриксом, состоит из небольших участков ДНК (120 – 140 н. п,), гетерогенных по последовательностям. Они встречаются между участками ДНК длиной около 50 тыс. н. п., представляющих собой, вероятно, петли основной массы хроматина. Функциональное значение второй группы этих коротких участков ДНК может заключаться в том, что они ассоциированы с белками, лежащими в сердцевинах розеткоподобных структур хроматина или в основании развернутых петель ДНК хроматина при его активации.

При изучении кинетики гидролиза, вновь синтезируемой ДНК нуклеазами было обнаружено, что ядерный матрикс связан с репликацией ДНК . Большая часть ДНК, содержащая радиоактивную метку, связана с матриксом: свыше 70% новосинтезированной ДНК было локализовано в зоне внутреннего ядерного матрикса. Это наблюдение давало основание считать, что на ядерном матриксе происходят инициация и собственно репликация ДНК . Фракция ДНК, ассоциированная с ядерным матриксом, оказалась обогащенной репликативными вилками. В составе ядерного матрикса обнаружена ДНК-полимераза а – основной фермент репликаций ДНК . Кроме него с ядерным матриксом связаны и другие ферменты репликативного комплекса (реплисомы): ДНК-праймаза, ДНК-лигаза, ДНК-топоизомераза II. В состав белков внутреннего ядерного матрикса входит РНК-полимераза II, ответственная за синтез информационных РНК. С ядерным матриксом связаны собственно транскрибируюшиеся гены. Транскрипционные комплексы закреплены на ядерном матриксе, а сама транскрипция осуществляется одновременно с перемещением матричнои ДНК относительно закрепленных транскрипционных комплексов, содержащих РНК- полимеразу II. Кроме тРНК и ее предшественников в составе ядерного белкового матрикса обнаруживаются малые ядерные рибонуклеопротеиды (мяРНП), которые участвуют в созревании информационных РНК, в процессе сплайсинга. Эти РНК-содержащие частицы, иногда называемые сплайсосомами , собраны в группы, или кластеры, связанные с белками ядерного матрикса. Элементы ядерного матрикса могут прямо участвовать в регуляции транскрипции.

475.98 Кб. Глава 6. Ядерный белковый матрикс

Общий состав ядерного матрикса

Мы уже познакомились с тем, что в интерфазном ядре развернутые

хромосомы располагаются не хаотично, а строго упорядоченно. Такая

организация хромосомы в трехмерном пространстве ядра необходима не только

для того, чтобы при митозе происходила сегрегация хромосом, их обособление

от соседей, но и кроме того необходима для упорядочения процессов

репликации и транскрипции хроматина. Можно предполагать, что для

осуществления этих задач должна существовать какая-то каркасная

внутриядерная система, которая может служить объединяющей основой для

всех ядерных компонентов – хроматина, ядрышка, ядерной оболочки. Такой

структурой является белковый ядерный остов или матрикс . Необходимо

сразу же оговориться, что ядерный матрикс не представляет собой четкой

морфологической структуры: он выявляется как отдельный морфологический

гетерогенный компонент при экстракции из ядер практически всех участков

хроматина, основной массы РНК и липопротеидов ядерной оболочки. От ядра,

которое не теряет при этом своей общей морфологии, оставаясь сферической

структурой, остается как бы каркас, остов, который иногда называют еще

«ядерным скелетом».

Впервые компоненты ядерного матрикса (остаточные ядерные белки) были

выделены и охарактеризованы в начале 60-х годов. Было обнаружено, что при

последовательной обработке изолированных ядер печени крыс 2 М раствором

NaCI, а затем ДНКазой, происходит полное растворение хроматина, а

основными структурными элементами ядра остаются: ядерная оболочка,

связанные с ней компоненты – нуклеонемы (ядерные нити), содержащие белок

и РНК, и ядрышки. Была высказана гипотеза, что фибриллы хроматина в

нативных ядрах прикреплены к этим осевым белковым нитям наподобие

«ершика для чистки бутылок» (см.

Значительно позднее (середина 70-х годов) эти работы получили развитие и

привели к появлению массы новых сведений о нехроматиновых белках

ядерного остова и о его роли в физиологии клеточного ядра. В это же время был

предложен термин «ядерный матрикс» для обозначения остаточных структур

ядра, которые могут быть получены в результате последовательных экстракций

ядер различными растворами. Новым в этих приемах было использование

неионных детергентов, таких как Тритон Х-100, растворяющих ядерные

липопротеидные мембраны.

Последовательность обработки выделенных ядер, приводящая к получению

препаратов ядерного матрикса, обогащенного белком, следующая (см. т

Таблица 6

. Экстракция (в %) ядерных компонентов в процессе получения

ядерного белкового матрикса

Обработка

Фосфолипи

1.Изолированны

2. 0,2 мМ MgCl

4. 1% Тритон Х-

5.ДНКаза+РНКа

Изолированные ядра, полученные в растворах 0,25 М сахарозы, 0,05 М Трис-

HCI буфера и 5 мМ MgCI

помещались в раствор низкой ионной силы (LS), где

деградировала основная масса ДНК за счет эндонуклеазного расщепления. В 2

М NaCI (HS) в дальнейшем происходила диссоциация хроматина на гистоны и

ДНК, шла дальнейшая экстракция фрагментов ДНК и различных белков.

Последующая обработка ядер в 1% растворе Тритона Х-100 приводила почти к

полной потере фосфолипидов ядерной оболочки и получению ядерного

матрикса (NM), содержащего остатки ДНК и РНК, которые дополнительно

растворялись при обработке нуклеазами, в результате чего получали конечную

фракцию ядерного белкового матрикса (NPM). Он состоит на 98% из

негистоновых белков, в него, кроме того, входит 0,1% ДНК, 1,2% РНК, 1,1%

фосфолипидов.

Химический состав ядерного матрикса, полученный таким способом сходен у

различных объектов (см.

Таблица 7

Фосфолипи

Крыса, печень 97 0,1 1,2

Клетки HeLa

Тетрахимена 97 0,1

По своей морфологической композиции ядерный матрикс состоит,по крайней

мере, из трех компонентов: периферический белковый сетчатый (фиброзный)

слой – ламина (nuclear lamina, fibrous lamina), внутренняя или

интерхроматиновая сеть (остов) и «остаточное» ядрышко (

Ламина представляет собой тонкий фиброзный слой, подстилающий

внутреннюю мембрану ядерной оболочки. В ее состав входят так же комплексы

ядерных пор, которые как бы вмурованы в фиброзный слой. Часто эту часть

ядерного матрикса называют фракцией «поровый комплекс – ламина» (PCL –

“pore complex – lamina”). В интактных клетках и ядрах ламина большей частью

морфологически не выявляется, т.к. к ней тесно прилегает слой

периферического хроматина. Лишь иногда ее удается наблюдать в виде

относительного тонкого (10-20 нм) фиброзного слоя, располагающегося между

внутренней мембраной ядерной оболочки и периферическим слоем хроматина.

Структурная роль ламины очень велика: она образует сплошной фиброзный

белковый слой по периферии ядра, достаточный для того, чтобы поддерживать

морфологическую целостность ядра. Так удаление обеих мембран ядерной

оболочки с помощью Тритона Х-100 не вызывает распада, растворения ядер.

Они сохраняют свою округлую форму и не расплываются даже в случае

перевода их в низкую ионную силу, когда происходит набухание хроматина.

Внутриядерный остов или сеть морфологически выявляется только после

экстракции хроматина. Он представлен рыхлой фиброзной сетью,

располагающейся между участками хроматина, часто в состав этой губчатой

сети входят различные гранулы РНП-природы.

Наконец, третий компонент ядерного матрикса – остаточное ядрышко –

плотная структура, повторяющая по своей форме ядрышко, также состоит из

плотно уложенных фибрилл.

Морфологическая выраженность этих трех компонентов ядерного матрикса,

так же как и количество во фракциях, зависит от целого ряда условий обработки

ядер. Лучше всего элементы матрикса выявляются после выделения ядер в

относительно высоких (5 мМ) концентрациях двухвалентный катионов.

Обнаружено, что для выявления белкового компонента ядерного матрикса

большое значение имеет образование дисульфидных связей. Так если ядра

предварительно инкубировать с иодацетамидом, препятствующим образованию

S-S связей, а затем вести ступенчатую экстракцию, то ядерный матрикс

представлен только комплексом PCL. Если же использовать тетратионат

натрия, вызывающий замыкание S-S связей, то ядерный матрикс представлен

всеми тремя компонентами. В ядрах, предварительно обработанных

гипотоническими растворами, выявляются только ламина и остаточные

Все эти наблюдения привели к выводу, что компоненты ядерного матрикса

представляют собой не застывшие жесткие структуры, а компоненты,

обладающие динамической подвижностью, которые могут меняться не только в

зависимости от условий их выделения, но и от функциональных особенностей

нативных ядер. Так, например, в зрелых эритроцитах кур весь геном

репрессирован и хроматин локализован преимущественно на периферии ядра, в

этом случае внутренний матрикс не выявляется, а только ламина с порами. В

эритроцитах 5-дневных куриных эмбрионов, ядра которых сохраняют

транскрипционную активность, элементы внутреннего матрикса выражены

отчетливо.

Как было видно из

7, основной компонент остаточных структур ядра –

ядерного матрикса из разных клеток довольно близок. Характерными для него

являются три белка фиброзного слоя, и носящих название ламинов . Кроме этих

основных полипептидов в матриксе присутствует большое количество

минорных компонентов с молекулярными массами от 11-13 до 200 кД.

Ламины представлены тремя белками (ламины A, B, C). Два из них, ламины

A и C, близки друг к другу иммунологически и по пептидному составу. Ламин

B от них отличается тем, что он представляет собой липопротеид и поэтому он

более прочно связывается с ядерной мембраной. Ламин B остается в связи с

мембранами даже во время митоза, тогда как ламины А и С освобождаются при

разрушении фиброзного слоя и диффузно распределяются по клетке.

Как оказалось, ламины близки по своему аминокислотному составу

промежуточным микрофиламентам (виментиновым и цитокератиновым),

входящим в состав цитоскелета. Часто фракция выделенных ядер, а также

препараты

ядерного

матрикса

значительные

количества

промежуточных филаментов, которые остаются связанными с периферией ядра

даже после удаления ядерных мембран.

В отличие от промежуточных филаментов ламины при полимеризации не

образуют нитчатых структур, а организуются в сети с ортогональным типом

укладки молекул. Такие сплошные решетчатые участки, подстилают

внутреннюю мембрану ядерной

оболочки, могут разбираться при

фосфорилировании

ламинов, и

полимеризоваться

дефосфорилированиии, что обеспечивает динамичность как этого слоя, так и

всей ядерной оболочки.

Молекулярная характеристика белков внутриядерного остова детально еще

не разработана. Показано, что в его состав входят ряд белков, принимающих

участие в доменной организации ДНК в интерфазном ядре в создании

розетковидной, хромомерной формы упаковки хроматина. Предположение о

том, что элементы внутреннего матрикса представляют собой сердцевины

розеточных структур хромомеров находит подтверждение в том, что

полипептидный состав матрикса интерфазных ядер (за исключением белков

ламины) и остаточных структур метафазных хромосом (осевые структуры или

«скэффолд») практически одинаковы. В обоих случаях эти белки отвечают за

поддержание петлевой организации ДНК.

ДНК ядерного белкового матрикса

Рассматривая особенности ДНК, входящей в состав ядерного матрикса,

необходимо еще раз подчеркнуть, что эта остаточная ДНК представлена в

минимальном количестве (0,1-1% от сухого веса фракции) составляет лишь

менее 1% от всей ДНК ядра. Эта ДНК оказалась устойчивой к действию

нуклеаз, вероятно за счет ее существования в виде прочных ДНК-белковых

комплексов.

Большой интерес представляет изучение фрагментов ДНК, входящих в состав

ядерного матрикса. Расчеты показали, что в ядрах существует от 60000 до

125000 участков ДНК, защищенных от действия нуклеаз и эти участки могут

быть расположены на всех трех компонентах ядерного матркса.

Подробно изучена ДНК ядерного матрикса клеток асцитной карциномы

Эрлиха мышей. Так были обнаружены две размерные группы фрагментов ДНК

в составе ядерного матрикса. В первую группу входили высокомолекулярные

фрагменты размером около 10 т.п.н., они составляли всего 0,02% от исходного

количества ДНК. Их число составляло примерно 100 на гаплоидный набор

хромосом, т.е. всего2-3 участка прикрепления ДНК к ядерному матриксу на

хромосому. Эти фрагменты были обогащены сателлитной ДНК и были связаны

с ламиной. Функциональное значение этих участков может состоять в

обеспечении фиксированного положения хромосом в ядре с помощью

закрепления их определенных участков (центромер, теломер) на ламине.

Вторая группа фрагментов, связанных с матриксом, состояла из небольших

участков ДНК (120-140 п.н.), гетерогенных по последовательности. Они

встречаются между участками ДНК длиной около 50 т.п.н., представляющих

собой, вероятно петли основной массы хроматина (

69). Функциональное

значение второй группы этих коротких участков ДНК может заключаться в том,

что они ассоциированы с белками, лежащими в сердцевинах розеткоподобных

структур хроматина или в основании развернутых петель ДНК хроматина при

его активации.

Сходные результаты были получены на многих объектах. Было обнаружено,

что зоны (районы) связывания ДНК с матриксом (MAR – matrix attachment

regions или SAR – scaffold attachment regions) содержат приблизительно 200 п.н.

и располагаются друг от друга на расстоянии 5-112 т.п.н. У дрозофилы на ядро

приходится по крайней мере 10 000 таких MAR (или SAR) областей.

Места расположения последовательностей SAR (MAR) очень сходны или

даже идентичны с местами связывания ДНК с топоизомеразой II, которая играет

основную структурную и ферментативную роль в образовании петель

хроматина. Более того один из белков матрикса («скэффолда») митотических

хромосом, белок Scl оказался просто топоизомеразой II. С помощью

иммунофлуоресценции было показано, что на интерфазных хромосомах Scl

локализуется в основании петель ДНК.

При изучении кинетики гидролиза вновь синтезированной ДНК нуклеазами

было обнаружено, что ядерный матрикс связан с репликацией ДНК. Было

обнаружено, что большая часть ДНК, содержащая радиоактивную метку,

связана с матриксом: свыше 70% новосинтезированной ДНК было локализовано

в зоне внутреннего ядерного матрикса. Это наблюдение давало основание

репликация ДНК. Фракция ДНК, ассоциированная с ядерным матриксом,

оказалась обогащенной репликативными вилками. В составе ядерного матрикса

обнаружена ДНК-полимераза

a, основной фермент репликации ДНК. Кроме

него с ядерным матриксом связаны и другие ферменты репликативного

комплекса (реплисомы): ДНК-праймаза, ДНК-лигаза, ДНК-топоизомераза II.

Высказана гипотеза о том, что репликация ДНК осуществляется таким образом,

что петли ДНК как бы протягиваются через закрепленные в матриксе

репликационные комплексы (

70). Было обнаружено, что участки начала

репликации ДНК располагаются вблизи (или совпадают с ними) участков

постоянного прикрепления ДНК к ядерному матриксу.

В состав ядерного матрикса входит около 1% РНК, включающей в себя как

гетерогенную высокомолекулярную РНК, так и рибосомную РНК, и РНК

ядерных малых РНП. На возможность связи элементов матрикса с процессами

транскрипции указывали данные о том, что при коротком мечении матрикс

обогащался быстро меченной гетерогенной РНК. Было обнаружено, что в

состав белков внутреннего ядерного матрикса входит РНК-полимераза II,

ответственная за синтез информационных РНК. С ядерным матриксом клеток

яйцеводов кур оказалась связанной большая часть (95%) новосинтезированных

пре-мРНК овальбумина и пре-рРНК. Эти наблюдения привели к заключению,

что ядерный матрикс может выполнять структурную роль в синтезе,

процессинге и транспорте РНК в ядре.

С ядерным матриксом связаны собственно транскрибирующиеся гены.

Транскрипционные комплексы закреплены на ядерном матриксе, а сама

транскрипция осуществляется одновременно с перемещением матричной ДНК

относительно закрепленных транскрипционных комплексов, содержащих РНК-

полимеразу II. Кроме тРНК и ее предшественников в составе ядерного

белкового матрикса обнаруживаются малые ядерные рибонуклеопротеиды (мя

РНП), которые участвуют в созревании информационных РНК, в процессе

сплайсинга (см. ниже). Эти РНК-содержащие частицы, иногда называемые

сплайсосомами , собраны в группы или кластеры, связанные с белками

ядерного матрикса.

Элементы ядерного матрикса могут прямо участвовать в регуляции

транскрипции. Так участки MAR обычно связаны с такими регуляторными

последовательностями на ДНК как энхансеры и сайленсеры, определяющими

интенсивность

транскрипционных

процессов. На

матриксе

локализованы белки-рецепторы для ряда стероидных гормонов.

Относительно связи ДНК с элементами ядерного матикса на сегодня

сложились представления о том, что эта связь может отражать различные

функциональные особенности. Так связь ДНК с ламиной может отражать

структурную, постоянную ассоциацию ДНК, а связь с внутренними элементами

– функциональную, связанную как с синтезом ДНК, так и РНК,

Поведение белков ядерного матрикса во время митоза изучено еще далеко

недостаточно. О судьбе ламины при митозе уже было сказано: ее компоненты

разбираются, частично переходя в цитоплазму, частично (ламин В) оставаясь в

связи с мембранами. Относительно компонентов внутриядерного матрикса

сведений меньше: известно, что часть этих белков входит в состав матрикса

(«скэффолда») митотических хромосом.

Четвертый – хромонемный уровень упаковки хроматина

Исследуя структурную организацию хроматина и хромосом можно

определенно говорить о нескольких уровнях компактизации ДНК. Первый –

нуклеосомный, дающий 7-кратное уплотнение ДНК в составе фибрилл ДНП,

второй – 30 н.м. фибрилла или нуклеомерный уровень с40--70-кратной

степенью упаковки, третий – доменно-петлевой или хромомерный приводящий

к 600-700-кратному уплотнению ДНК в составе этих структур. Для

поддержания первых двух уровней компактизации было достаточно участие

только гистоновых белков, тогда как петлевые и розетко-подобные доменные

структуры уже требовали участия негистоновых белков, и перехода от

спирального или соленоидного типа укладки ДНК к образованию компактных

глобулярных структур, состоящих из петель хроматиновых 30-нм фибрилл, к

структурам типа хромомеров , имеющих уже размеры 0,1-0,2 мкм.

Однако еще в классических работах цитологов начала ХХ века как в

интерфазных ядрах, так и, особенно, в митотических хромосомах описывались

нитчатые структуры – хромонемы , имеющие толщину 0,1-0,2 мкм. Их

удавалось наблюдать как на фиксированных объектах, так и в живых клетках.

Подробные исследования ультраструктуры митотических хромосом на разных

этапах митоза с помощью электронной микроскопии полностью подтвердило

наличие этого четвертого уровня компактизации хроматина (

При изучении ультраструктурных основ строения митотических хромсом

необходимо учитывать хромонемный уровень компактизации хроматина.

Хромонему – нитчатую хроматиновую структуру со средней толщиной 0,1-0,2

мкм удается проследить в естественных условиях на разных стадиях начальной

конденсации хромосом в профазе митоза и при деконденсации хромосом в

телофазе. Причем такие хромонемы выявляются как в клетках растений, так и

животных (

Изучение профазных хромосом как животных, так и растений показывает, что

процесс конденсации хромосомного материала включает в себя промежуточный

этап – образование из фибрилл ДНП нитчатых хромонемных структур,

являющихся единицей последующей хромосомной структуризации.

В естественных условиях в составе метафазных хромосом хромонемные

элементы на ультратонких срезах не выявляются. Но по мере деконденсации

митотических хромосом в поздней анафазе и ранней телофазе снова можно

видеть признаки хромонемной организации хромосом. В поздней анафазе, когда

хромосомы достигают противоположных полюсов клетки, в их структуре снова

выявляются хроматиновые нитчатые образования с толщиной 0,2 мкм. При

этом вся структура хромосом разрыхляется, что отражает начало общей

деконденсации митотических хромосом. Эта начальная стадия деконденсации

связана не с разрыхлением фибрилл ДНП внутри хромонем, а с расхождением,

обособлением участков хромонемы друг от друга. Особенно заметным и

выраженным этот процесс становится в телофазе. В это время хромосомы

начинают увеличиваться в объеме, при этом расстояние между отдельными

участками хромонемы также возрастает. В расположении отдельных нитей

хромонемы, так же как и в профазных хромосомах, улавливаются признаки

спиральности в их укладке: часто видны кольчатые или петлистые незамкнутые

участки, иногда располагающиеся параллельно друг другу. Спиральность

хромонемы в составе митотических хромосом удается наблюдать в ряде случаев

при частичной искусственной деконденсации выделенных митотических

хромосом (

74). В поздней телофазе хромосомы уже полностью окружены

ядерной оболочкой. Хромонемные элементы расходятся на значительные

расстояния, но все же зоны отдельных хромосом еще выявляются. В это время

некоторые участки хромонем начинают разрыхляться, их толщина взрастает.

Таким образом, наблюдая за состоянием структуры и расположением

хромонемных участков в ядрах и хромосомах в телофазе, можно видеть

картину, обратную той, что наблюдалась в профазе: разрыхление хромосом за

счет первоначального расхождения участков хромонемы и последующего их

разрыхления, деконденсации самих хромонем.

Ультраструктурная организация хромонемного уровня упаковки ДНП

хорошо выявляется при постепенном экспериментальном разрыхлении

хромосом при понижении концентрации двухвалентных катионов. Оказалось,

что плотное тело митотических хромосом сначала разрыхляется так, что

выявляется его хромонемная организация: на срезах видно, что хромосомы

представлены сечениями толстых (0,1-0,2 мкм) хромосомных нитей, хромонем

73). Затем, при последующем снижении концентрации двухвалентных

катионов, происходит как бы распад хромонемных элементов на множество

линейно расположенных глобулярных блоков хроматина с диаметром около

0,1-0,2 мкм. В

дальнейшем

блоки (хромомеры) начинают

деконденсироваться: на их периферии видны петли фибрилл ДНП, а в центре

остается тело хромомера. Возникает розеткоподобная структура. Важно

отметить, что расположение зон с розеткоподобными хромомерами совпадает с

рисунком G-бэндирования хромосом. По мере дальнейшей деконденсации

петли увеличиваются в длину, а центральные участки хромомеров прогрессивно

уменьшаются. При полной деконденсации все тело хромосомы представлено на

срезах равномерно расположенным фибриллами ДНП.

Надо отметить, что в современных молекулярно биологических

исследованиях строения хромосом хромонемный уровень, как один из высших

уровней упаковки ДНП, совершенно выпадает из поля зрения исследователей.

Лишь в последнее время некоторые исследователи на основании косвенных

данных приходят к выводам о наличии в интерфазных ядрах хромонемо-

подобных структур.

Поддерживающая форму и некоторые особенности морфологии ядра. В состав ядерного матрикса входят ядерная ламина , остаточное ядрышко и так называемый диффузный матрикс - сеть филаментов и гранул, соединяющих ядерную ламину с остаточным ядрышком .

Впервые компоненты ядерного матрикса были выделены и описаны в начале 1960-х годов . Термин «ядерный матрикс» был введён в середине 1970-х годов в связи с накоплением сведений о нехроматиновых белках ядерного скелета и его роли в функционировании клеточного ядра. Термин был введён для обозначения остаточных структур ядра, которые могут быть получены в результате последовательных экстракций ядер .

Описание [ | ]

Ядерный матрикс можно получить при обработке изолированных ядер нуклеазами и последующей экстракции гистонов 2М раствором NaCl . Как таковой ядерный матрикс не является чёткой морфологической структурой . Состав ядерного матрикса, оставшегося после экстракции из ядра хроматина и удаления ядерной оболочки при помощи неионных детергентов , а также удаления остатков ДНК и РНК при помощи нуклеаз, сходен у различных объектов. Он на 98 % состоит из негистоновых белков , а также содержит 0,1 % ДНК, 1,2 % РНК и 1,1 % фосфолипидов . Белковый состав ядерного матрикса примерно одинаков в клетках разных типов. Для него характерно присутствие ламинов , а также многих минорных белков массами от 11-13 до 200 кДа .

Морфологически ядерный матрикс состоит из ядерной ламины, диффузного матрикса (также известного как внутренняя, или интерхроматиновая, сеть) и остаточного ядрышка. Ламина представляет собой белковый сетчатый слой, выстилающий внутреннюю мембрану ядерной оболочки . Диффузный матрикс выявляется только после выделения из ядра хроматина. Он представляет собой рыхлую фиброзную сеть, расположенную между участками хроматина. Иногда в его состав входят рибонуклеопротеиновые гранулы. Остаточное ядрышко - это плотная структура, повторяющая формой ядрышко и состоящая из плотно уложенных фибрилл .

Петли ДНК, которые связаны с ядерным матриксом, являются обособленными топологическими доменами . Показано, что в ядрах имеется от 60 000 до 125 000 участков ДНК, защищённых от нуклеаз и расположенных на всех трёх компонентах ядерного матрикса. Для образования участков прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу важны MAR-элементы (SAR, S/MAR) - элементы генома , которые специфически связываются с изолированным ядерным матриксом в условиях in vitro . В состав этих элементов входит ДНК длиной около 200 пар оснований , и они располагаются на расстоянии от 5 до 112 000 п. н. друг от друга. У фруктовой дрозофилы в ядре имеется как минимум 10 000 MAR .

Места расположения элементов MAR очень сходны с сайтами связывания ДНК с , задействованной в образовании петель хроматина. Показано, что ядерный матрикс связан с репликацией ДНК : более 70 % новосинтезированной ДНК локализуется в зоне внутреннего ядерного матрикса. Фракция ДНК, связанная с ядерным матриксом, обогащена репликативными вилками. Кроме того, в составе ядерного матрикса обнаружена